L-薄荷醇是来源于植物薄荷的具有清凉香气的单萜类物质，是薄荷精油的主要成分，被广泛用于食品、医疗、化妆品和烟草等行业。然而，随着市场对L-薄荷醇需求的不断增加，使得依赖于植物提取的L-薄荷醇难以满足市场需求。为此，一些企业如德国的巴斯夫SE（BASF SE）和德之馨（Symrise）及日本的高砂（Takasago）转而通过化学合成的方法来获得L-薄荷醇。在L-薄荷醇的化学合成路线中，对于合成的D, L-薄荷醇进行化学拆分来制备L-薄荷醇，经常会用到一些过渡态的金属催化剂和有机溶剂，容易对人体和环境产生危害。相比之下，酶法拆分具有反应条件温和，对人体和环境友好以及高效率和高选择性的优点。

图1 基于半理性设计改造枯草芽孢杆菌酯酶用于D, L-薄荷乙酸酯的选择性拆分策略

针对目前已经报道的用于拆分D, L-薄荷酯的酶，存在如底物浓度耐受性低、催化选择性低及催化体系需要有机助溶剂等问题。陈小龙教授团队首先从枯草芽孢杆菌（Bacillus. subtilis）中筛选到一个酯酶pnbA，其针对D, L-薄荷乙酸酯，在添加乙醇作为助溶剂的情况下，最高底物转化率只有47.8%，产物立体选择性为80%，E=19.95。为了提高野生型pnbA针对D, L-薄荷乙酸酯的催化效率和L-对映体选择性，特别是在无有机助溶剂的催化体系中，陈小龙教授团队基于分子对接结果，对该酯酶进行了迭代饱和突变和基于三密码子饱和突变策略进行的迭代突变。最终，筛选到三株能够满足产业应用的突变株III-5-M（Y109M/L110Y/M193Y/I270M/F314Y）、III-7（Y109M/L110Y/M193Y/I270M/L273V/F314Y/L362V）和III-5-Y（Y109M/L110Y/M193Y/I270Y/F314Y），当底物浓度为200 g/L时，它们的L-对映选择性在无有机溶剂体系中始终保持在99%以上，E>300，对D,L-乙酸薄荷酯的转化率最高为45.9%。该研究为生物拆分制备L-薄荷醇的工业化生产提供了具有应用潜力的生物催化剂。

图 2. 基于三密码子饱和突变的pnbA突变研究

相关工作以“Enhancing the Enantioselectivity and Catalytic Efficiency of Esterase from Bacillus subtilis for Kinetic Resolution of l-Menthol through Semirational Design”为题发表在《Journal of Agricultural and Food Chemistry》陈小龙教授团队青年教师周家伟为第一作者，朱林江副教授为通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金（82104322）、浙江省自然科学基金（LQ22H280012）和浙江省重点研发计划项目（2019C01085）的资助。

论文信息：

Jiawei Zhou, Yumin Sang, Zhuang Wang, Jiacheng Feng, Linjiang Zhu, and Xiaolong Chen. Enhancing the Enantioselectivity and Catalytic Efficiency of Esterase from Bacillus subtilis for Kinetic Resolution of l-Menthol through Semirational Design[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2024.

论文链接：

https://doi.org/10.1021/acs.jafc.3c08321