郑裕国院士团队郑仁朝教授课题组在《ACS Catalysis》发表关于腈水解酶反应选择性双向调控新进展
作者:汤晓玲 来源: 发布日期:2023-08-07 浏览次数:784

一般认为,腈水解酶仅能催化腈化合物水解生成相应羧酸和氨。随着研究的深入,一些腈水解酶发现同时具有腈水合活性(催化腈化合物生成酰胺)存在催化混乱性( catalytic promiscuity。通过腈水解酶反应选择性正向调控消除腈水合活性,可以提高收率,减轻分离压力;通过反向调控强化腈水合活性,可以创制氰基耐受型腈水合酶,实现α-氨基酰胺的高效合成。因此,腈水解酶反应选择性调控是挖掘和拓展腈水解酶生物合成新功能的关键。

浙江工业大学郑裕国院士团队长期致力于腈转化酶生物催化基础研究和工程科技创新,在腈水解酶筛选改造、催化机制和工业应用等方面开展了系统研究。近期,团队通过计算机辅助设计,建立了基于腈水解酶关键残基进攻底物特征距离的反应选择性调控新策略,首次实现了腈水解酶的反应选择性的双向调控(图1)。

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图1 计算机辅助的腈水解酶反应选择性调控策略


在该研究中,通过对腈水解酶催化机理的分析,提出了影响其反应选择性的分子机制:催化三联体中CysGlu残基之间(DC-E)的距离以及Glu残基与底物氰基(-CN)之间的距离(DCN-E)共同决定反应方向。当DC-E较大时,形成稳定的四面体结构,质子由 Glu 残基转移至氰基,反应朝羧酸生成方向进行;反之,当DCN-E较大时,质子传递链转向 Cys 残基,消除硫醇结构,反应朝酰胺生成方向进行(图2)。

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图2 腈水解酶反应选择性的分子机制

基于此,通过结构模拟、结合自由能(ΔΔG)计算和动力学模拟分析,锚定了13个影响DC-EDCN-E特征距离的关键氨基酸残基,结合湿法实验,确定8个突变体对腈水解酶的反应选择性具有显著影响(图3)。

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3 腈水解酶反应选择性调控关键位点筛选

进一步对以上突变体对应的残基进行饱和突变和迭代突变,获得了分别具有腈水解专一性和腈水合专一性的突变体。其中,三突变体K200R/R224W/N246V催化苯乙腈产生羧酸的含量从50.9%提升至98.5%,而六突变体A87M/I91P/I136Q/M164V/R224S/V226R产生的酰胺含量从49.1%提高至96.4%(图3)。同样,三突变体催化苯乙腈产生的羧酸含量提高至95.1%,六突变体产生的酰胺含量提高至98.8% 

  通过对野生酶及其突变体的结构功能关系研究发现,野生型的DC-EDCN-E值分别为 4.6 4.5 ,而三突变体两者的距离分别为4.4 3.5 ,由于DC-E显著大于DCN-E,使该突变体催化的反应更易向羧酸生成方向进行。而六突变体的DCN-E显著大于DC-E,使其催化的反应更易向酰胺生成的方向进行。

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图4 腈水解酶突变体关键残基进攻底物的特征距离 

此外,腈水解酶具有典型的界面结构,其“A”界面和“C”界面氨基酸对催化性能具有重要影响。作者考察了有益突变点的的分布情况。结果表明,突变体中所涉及的残基K200, V226N246位于“A”界面,而A87, I91M164均位于“C”界面,其中R224同时位于“A”界面和“C”界面,它们共同影响了酶的催化性能。

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图5 腈水解酶突变位点的界面分布

通过本研究,建立了腈水解反应选择性双向精准调控的新方法,有效拓展了腈水解酶生物有机合成新功能,为酶催化混乱性分子设计提供了新视角和新思路。

以上研究成果以“Bidirectional Regulation of Nitrilase Reaction Specificity by Tuning the Characteristic Distances between Key Residues and Substrate”为题发表于《ACS Catalysis》(2023, 13, 10282-10294)。郑裕国院士团队汤晓玲副教授为第一作者,郑仁朝教授为通讯作者。本研究得到国家自然科学基金(3217125721978269)的支持。


论文信息:Xiao-Ling Tang, Peng-Fei Wen, Wen Zheng, Xuan-Ye Zhu, Yan Zhang, Hong-Juan Diao, Ren-Chao Zheng*, and Yu-Guo Zheng.Bidirectional Regulation of Nitrilase Reaction Specificity by Tuning the Characteristic Distances between Key Residues and Substrate.ACS Catal. 2023, 13, 1028210294.

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文章链接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.3c02670


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